糖异生反应将线粒体丙酮酸转化为胞质葡萄糖6-磷酸，而胞质葡萄糖6-磷酸又可被水解为葡萄糖并从细胞输出。糖异生局限于肝和肾细胞，在没有外源葡萄糖的情况下，可以从乳酸、丙氨酸和其他氨基酸分子中合成葡萄糖(例如，Gerich 1993年的综述)。糖异生过程分为两部分:一个反应网络将线粒体丙酮酸转化为胞质磷酸烯醇丙酮酸;然后磷酸烯醇丙酮酸在一个单一的胞质反应序列转化为葡萄糖6-磷酸。

这一过程的第一部分有三种变体在生理学上很重要。1)一系列的转运和转氨化反应将线粒体草酰乙酸转化为胞质草酰乙酸，胞质草酰乙酸通过激素调控的磷酸烯醇丙酮酸激酶胞质亚型转化为磷酸烯醇丙酮酸。这种变体允许调节乳酸合成葡萄糖。2)线粒体草酰乙酸还原为苹果酸，苹果酸出口到胞质，再氧化为草酰乙酸。这种变体提供了由氨基酸(如丙氨酸和谷氨酰胺)合成葡萄糖所需的胞质还原等价物。3)组成型表达的线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化线粒体草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸，然后转运到胞质。任何一个丙酮酸分子通过这个反应网络所遵循的确切路径是由反应发生的组织、丙酮酸的来源以及触发糖异生的生理应激所决定的。

在所有情况下，来自两个丙酮酸分子的葡萄糖的合成需要两种还原当量作为细胞溶质Nadh + H +的产生和消耗。对于衍生自乳酸（变体1和3）的丙酮酸，通过乳酸乳酸氧化在胞质溶胶中产生NadH + H +（图中未显示的丙酮酸代谢的反应）。对于衍生自氨基酸（变体2）的丙酮酸，用谷氨酸脱氢酶产生的线粒体Nadh + H +（氨基酸代谢，未示出的反应）将草酸乙酸盐降低到苹果酸盐中，其被运输到胞质醇并重新氧化，产生细胞溶质NADH + H +。丙酮酸葡萄糖的合成还需要六种高能磷酸盐的消耗，来自ATP和来自GTP的两种。

在葡糖生成的第二部分中，通过反应转化为衍生的细胞溶磷酸丙酮酸酯，通过反应转化为果糖1,6-双磷酸酯，这是糖醇分解的步骤的相当。通过果糖1,6-双磷酸酶催化果糖1,6-双磷酸酯6-二磷酸酯的水解，果糖6-磷酸酯可逆地异构化以葡萄糖6-磷酸盐。