eNOS活性受多种翻译后修饰的调节，包括磷酸化和酰化，这些修饰还调节eNOS与其他蛋白质的相互作用及其亚细胞定位。
一般来说，在肉豆蔻酰化和棕榈酰化后，eNOS定位于质膜上的小窝，在静息细胞中，eNOS与小窝蛋白结合并保持不活性。几种提高细胞内钙浓度的激动剂促进钙调素与eNOS的结合和小窝蛋白与酶的分离，从而产生激活的eNOS钙调素复合物。
磷酸化在调节eNOS活性中起着重要的作用，特别是位于还原酶结构域的Ser1177的磷酸化，它通过增强还原酶活性和钙敏感性来提高酶的活性。在未刺激培养的内皮细胞中，Ser1177在各种刺激下迅速磷酸化:流体剪切应力、胰岛素、雌激素、VEGF或缓激肽。参与这一过程的激酶取决于所施加的刺激。例如，剪切应力通过激活Akt和PKA使Ser1177磷酸化;胰岛素同时激活Akt和AMPK;雌激素和VEGF主要通过Akt磷酸化eNOS;而缓激肽诱导的Ser1177磷酸化是由CaMKII介导的。当Ser1177被磷酸化时，NO的产生比基础水平增加数倍。
位于CaM结合域的苏氨酸残基（Thr 495）的磷酸化与eNOS活性的降低有关。当这个残基被去磷酸化时，更多的CaM与eNOS结合并提高酶活性。与Thr495去磷酸化相关的刺激（例如缓激肽、组胺和Ca2+离子载体）也会增加Ca2+水平，导致Ser1177的磷酸化。
其他磷酸化位点，如Ser114和Ser633，以及酪氨酸磷酸化都已被检测到，但它们的功能相关性尚不清楚。据推测，eNOS的酪氨酸磷酸化不太可能直接影响酶的活性，但更可能影响与相关支架和调节蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。
