RNase H催化将附着在含有负链DNA上的引物TRNA的粘合剂的精确切割，将3'PPT RNA引物与加号强止止DNA连接到Plus-Strand的强止止DNA，并将CPPT引物底漆底漆底漆底漆底漆合成它灌注。在每种情况下，发生RNA-DNA结附近的精确切割（Pullen等人1992）。HIV-1 RT是唯一的逆转录酶，其切割TRNA：DNA结，以便从减去股线的5'末端从TRNA离开RIBO残余物。

虽然单一的RT异二聚体可以是原则催化DNA合成和引物RNA：DNA键裂解，来自几种体外系统的证据表明，单独的RT异二聚体可能催化这两种反应（Rausch和Le Grice 2004）。