线粒体丙酮酸脱氢酶复合物催化丙酮酸、CoASH和NAD+反应生成乙酰辅酶a、CO2和NADH。该酶复合物包含三种不同蛋白质的多个拷贝，E1 α， E1 β， E2和E3，每个都有不同的催化活性(Reed和Hackert 1990;Zhou et al . 2001)。反应开始于丙酮酸氧化脱羧，由E1和β(丙酮酸脱氢酶)催化。与E1相关的脂酰胺辅因子同时被还原。然后，丙酮酸衍生的乙酰基在E2(二氢脂酰转乙酰酶)催化下分两步转移到辅酶A上。最后，在E3(二氢脂酰脱氢酶)催化下，脂酰胺的氧化形式被再生，电子通过两步转移到NAD+。这个反应的生化细节已经用丙酮酸脱氢酶复合物和亚单位从牛组织和其他非人来源纯化出来。有关相应人类蛋白作用的直接证据来自对患者表达突变型E1 α (Lissens et al. 2000)、E1 β (Brown et al. 2004)、E2 (Head et al. 2005)和E3 (Brautigam et al. 2005)的研究。