HSP90的辅助功能偶联于其ATP酶活性。我们目前对HSP90的ATPase机制的理解主要基于研究酿酒酵母HSP90复合物的结构和功能（Meyer P等人，2003,2004; Ali MM等，2006; Prodromou C等人2000; Prodromou C 2012）。人HSP90的ATPase循环不太理解，然而，若干研究表明，伴随ATP酶周期的潜在酶促机制和一组构象变化在两种物种中非常相似（Richter K等，2008; Vaughan CK等人。2009）。一旦ATP被约束，它有助于稳定闭合的ATP盖子状态，其中ATP的γ-磷酸盐提供氢键，该氢键能够通过N-末端结构域（NTD）促进ATP盖的稳定关联（ALI MM等人。2006; Prodromou C等人。2000; Chadli A等。2000）。然后，ATP与NTD的关联随后刺激NTD和中间域中的结构变化，其可能涉及在所结合的ATP上定位的每个N终端域内的ATP盖段的运动。盖子的运动暴露了随后参与Hsp90的N-末端结构域的瞬时二聚体的表面残留物（Ali MM等，2006; Prodromou C等人2000; Chadli A等人。2000）。此外，NTD与中间结构域的颈内关联导致Hsp90的催化环的主动构象，其致力于水解ATP（Meyer P等人。2003）。ATP结合的后续构象变化由共伴侣活性调节。例如，复合物中的STIP1结构域的布置似乎防止了HSP90单体的NTDS二聚化和高效HSP90介导的ATP水解所需的HSP90二聚体的总闭合（Southworth Dr＆Agard DA 2011; Alvira S等人。2014）。 In addition, client protein binding to HSP90 was found to increase ATPase activity of HSP90 up to 200-fold (McLaughlin SH et al. 2002).

在ATP水解后，从HSP90配合物中释放配体结合的类固醇激素受体（SHR）。反应模块描述了核中HSP90的ATP酶活性，但是在从HSP90复合物中通过核孔翻译了细胞骨激素结合的SHR易转移。