糖异生反应将线粒体丙酮酸转化为胞质葡萄糖6-磷酸，而胞质葡萄糖6-磷酸又可被水解为葡萄糖并从细胞输出。糖异生局限于肝和肾细胞，当外源葡萄糖无法获得时，糖可以从乳酸、丙氨酸和其他氨基酸分子中合成。如下图所示，糖异生过程分为两部分:一个可能的反应网络介导了线粒体丙酮酸到胞质磷酸烯醇丙酮酸的转化，而磷酸烯醇丙酮酸又通过单个胞质反应序列转化为葡萄糖6-磷酸。

在鸡身上，这个过程可以区分出三种变体，两种局限于肾脏，另一种同时发生在肾脏和肝脏。1)在肾脏中，来自线粒体草酰乙酸的碳原子通过一系列运输和转氨化反应生成胞质草酰乙酸，并通过胞质、激素调节的磷酸烯醇丙酮酸激酶PCK1转化为磷酸烯醇丙酮酸。这种变体允许调节乳酸合成葡萄糖。2)在肾脏中，线粒体草酰乙酸还原为苹果酸，苹果酸出口到胞质中，再氧化为草酰乙酸。这种变体提供了由氨基酸(如丙氨酸和谷氨酰胺)合成葡萄糖所需的胞质还原等价物。3)在肝脏和肾脏中，组成型表达的线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK2催化线粒体草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸，然后转运到胞质。第三种变体还允许乳酸合成葡萄糖(Soling et al. 1973;Wallace and Newsholme, 1967;沃特福德等人1981年;Weldon et al. 1990)。

在所有情况下，丙酮酸分子的代谢都需要产生和消耗一种还原性当量，即胞质NADH + H+。对于从乳酸衍生的丙酮酸(变种1和3)，NADH + H+是由乳酸在胞质中氧化成丙酮酸生成的(丙酮酸代谢反应在图中没有显示)。对于氨基酸衍生的丙酮酸(变体2)，谷氨酸脱氢酶(氨基酸代谢反应，未显示)产生的线粒体NADH + H+被用来将草酰乙酸还原为苹果酸，苹果酸被运输到胞质并再次氧化，生成胞质NADH + H+。丙酮酸的每个分子的代谢也需要消耗三种高能磷酸盐，两种来自ATP，一种来自GTP。

在糖异生的第二部分中，胞质磷酸烯醇丙酮酸通过与糖酵解步骤相反的反应转化为果糖1,6-二磷酸。果糖- 1,6-二磷酸酶催化果糖- 1,6-二磷酸水解成果糖- 6-磷酸，果糖- 6-磷酸可逆异构化成葡萄糖- 6-磷酸。