泛素单体由较大的前体加工，然后通过在泛素和E1活化酶的半胱氨酸残基之间形成硫醇酯键（UBA1或UBA6，Jin等，2007）。然后将泛素转移到E2缀合酶的活性位点半胱氨酸残基（在Van Wijk和Timmers 2010中审查，2014年克利埃尔和市长，Stewart等。2016）。含有多种泛素单体（多膦酸）的前体蛋白由UBB和UBC基因产生。含有与核糖体蛋白融合的单个泛素的前体是由UBA52和RPS27A基因产生的。蛋白酶胃蛋白和USP5在多泛素加工中非常活跃，而蛋白酶UCHL3，USP7和USP9X切割泛素 - 核糖体蛋白前体，产生泛素单体（Grou等，2015）。其他酶也可以加工泛素前体。由所得泛素单体通过其C-末端甘氨酸的腺苷酸活化，然后通过硫醇酯键将C-末端与E1酶UBA1或UBA6的半胱氨酸残基缀合（Jin等人，从兔同源物推断出来Haas等人。1982年，Hershko等。1983）。然后将泛素从E1酶转移到几种E2酶之一的半胱氨酸残基（在Van Wijk和Timmers 2010中审查，Stewart等，2016）。