一旦通过肉碱酰基转移酶进口到线粒体基质中，β-氧化就会开始。脂肪酸代谢的β-氧化螺旋涉及从脂肪酰基链的两种碳单元的重复去除。该方法有四个步骤：氧化，水合，第二氧化，最后硫酸分解。最后一步释放了两种碳乙酰辅酶和准备好的丙基辅酶，即另一个倾斜螺旋的丙基辅酶。在β-氧化螺旋的总旋转中，产生一个NADH，一个FADH2和一个乙酰COA。

通过三羧酸循环的进一步氧化乙酰-CoA产生额外的FadH2和NADH。所有还原的辅助因子都由线粒体电子传输链使用以形成ATP。脂肪酸分子的完全氧化产生了许多ATP分子。棕榈酸酯，用作该模型，生产129个ATP。

β-氧化途径对饱和和不饱和脂肪酸不同。饱和脂肪酸的β-氧化需要四种不同的酶促步骤。β-氧化产生并消耗反式配置的中间体;在CIS构型中具有粘合的不饱和脂肪酸需要三个单独的酶促步骤来制备用于β-氧化途径的这些分子。