编码转移RNA的基因在细胞核内由RNA聚合酶III转录。(不同的转录和加工过程也发生在线粒体中。)最初的转录本，pre-tRNAs，在5'端和3'端包含额外的核苷酸。6.3%(32 / 509)的人类trna中也含有内含子，这些内含子位于反密码子环中，距离反密码子3'。通过在细胞核和细胞质中的加工反应，去除附加的核苷酸，并将一个非模板化的CCA序列添加到最终的3'端(Nakanishi和Nureki 2005, Phizicky和Hopper 2010综述)。
对于不同的trna，其加工和核苷酸修饰的顺序可能是不同的，其分析由于逆行运输机制而变得复杂，逆行运输机制可以将trna从细胞质导入细胞核(逆行运动，Shaheen和Hopper, 2005年，在Phizicky 2005年综述)。通常，前trna的5'前导体首先被RNase P核糖核蛋白复合物内切酶去除，该复合物包含一个催化RNA(人类中的RNA H1)和至少10个蛋白质亚基(综述于Jarrous 2002, Xiao et al. 2002, Jarrous和Gopalan 2010)。
然后，3'拖车被RNase Z活性除去，RNase Z是人类的一种单一蛋白质(在Maraia和Lamichhane 2011年综述)。ELAC2是在细胞核和线粒体中发现的一种RNase Z。ELAC1细胞溶质中也可以作为一种核糖核酸酶z人类tRNA基因不编码通用受体3 '末端CCA,取而代之的是转录TRNT1,添加一个不同寻常的聚合酶,不需要核酸模板(回顾2006年熊和施泰茨,2010年后,获利和山下式2014)。
在人类中，内含子是通过与mRNA剪切不同的两步机制从细胞核中包含内含子的trna剪切而来的(综述见Popow et al. 2012, Lopes et al. 2015)。TSEN复合体首先将5'和3'切割到内含子上，在5'外显子上生成一个2'3'环磷酸，在3'外显子上生成一个5'羟基。在一个单一的反应中，这两个末端由一个包含至少6个蛋白质的复合物连接起来，这两个反应都水解了2'磷酸键，并将3'磷酸连接到5'羟基上。(在酵母中，2'磷酸的连接和水解是两个独立的反应。酵母中的剪接反应发生在线粒体外膜的细胞质中。
成熟转移rna包含大量转录后修饰反应产生的修饰核苷酸残基(Li and Mason 2014综述)。根据特定的tRNA，这些反应可能发生在剪接之前或之后，以及从细胞核输出到细胞质之前或之后。